辅酶ⅠNAD（H）含量检测试剂盒 微量法

辅酶Ⅰ NAD(H)含量检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0315
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：
1、试剂三：需要严格避光；
2、试剂六：19.2 mL乙醇和0.8 mL蒸馏水混合，备用；
3、NAD标准品：临用前加入1.5 mL蒸馏水，即2 µmol/mL，将其稀释为1.25 nmol/mL的NAD标准溶液备
用；
4、NADH标准品：临用前加入1.4 mL蒸馏水，即2 µmol/mL，将其稀释为1.25 nmol/mL的NADH标准溶液备用。
产品说明：
辅酶I包括还原型和氧化型两种形式，在生物氧化中起传递氢的作用。氧化型辅酶I又称烟*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是脱氢酶的辅酶，它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给NAD，使之成为NADH（还原型辅酶I）。而NADH则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式，合成ATP。NAD(H)在机体内有重要的生理意义，与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病的发生密切相关。体内辅酶I含量降低会导致细胞损伤或衰亡。
分别用酸性和碱性提取液提取样本中NAD⁺和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在570nm下检测吸光值，而NAD⁺可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤： 具体操作步骤详见“产品资料"附件
注意事项：
1、操作过程应避光。不可将试剂一、二、三混合后再加，必须分开加。
2、反应过程要注意避光。
3、当吸光值大于1时，建议稀释后测量。
实验实例：
 

1. NAD⁺的提取：称取约0.1g肌肉按照提取和测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.507-0.2=0.307，ΔA标准1=A标准1-A空白=0.612-0.144=0.468，按样本质量计算NAD⁺ 含量得：NAD⁺ (nmol/g 质量）=1.25×ΔA测定÷ΔA标准1÷W=1.25×0.307÷0.468÷0.1=8.1998 nmol/g 质量。

NADH的提取：称取约0.1g肌肉按照提取和测定步骤操作，用96孔板测测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.183-0.077=0.106，ΔA标准2=A标准2-A空白=0.399-0.143=0.256，按样本质量计算NADH 含量得：NADH  (nmol/g 质量）=1.25×ΔA测定÷ΔA标准2÷W=1.25×0.106÷0.256÷0.1=5.1758 nmol/g 质量。

1. NAD⁺的提取：称取约0.1g柳树叶，按照提取和测定步骤操作，用96孔板测测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.171-0.101=0.07，ΔA标准1=A标准1-A空白=0.612-0.144=0.468，按样本质量计算NAD⁺ 含量得：NAD⁺ (nmol/g 质量）=1.25×ΔA测定÷ΔA标准1÷W=1.25×0.07÷0.468÷0.1=1.8697 nmol/g 质量。

NADH的提取：称取约0.1g柳树叶，按照提取和测定步骤操作，用96孔板测测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.152-0.099=0.053，ΔA标准2=A标准2-A空白=0.399-0.143=0.256，按样本质量计算NADH 含量得：NADH  (nmol/g 质量）=1.25×ΔA测定÷ΔA标准2÷W=1.25×0.053÷0.256÷0.1=2.5879 nmol/g 质量。

1. NAD⁺的提取：取0.1mL火鸡血清，按照提取和测定步骤操作，用96孔板测测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.120-0.071=0.049，ΔA标准1=A标准1-A空白=0.612-0.144=0.468，按液体体积计算NAD⁺ 含量得：NAD⁺含量(nmol/mL）=12.5×ΔA测定÷ΔA标准1=12.5×0.049÷0.468=1.3088 nmol/mL。

NADH的提取：取0.1mL马火鸡血清，按照提取和测定步骤操作，用96孔板测测得计算ΔA测定管= A测定-A对照=0.089-0.065=0.024，ΔA标准2=A标准2-A空白=0.399-0.143=0.256，按液体体积计算NADH 含量得：NADH含量(nmol/mL）=12.5×ΔA测定÷ΔA标准2=12.5×0.024÷0.256=1.1719 nmol/mL。
相关发表文献：

1. Xiaofen Fu,Pengsong Li,Lei Zhang,et al. Understanding the stress responses of Kluyveromyces marxianus after an arrest during high-temperature ethanol fermentation based on integration of RNA-Seq and metabolite data. Applied Microbiology and Biotechnology. March 2019;103(6) :2715–2729.(IF3.67)

2. Mengqing Tao,Jia Jiang,Lin Wang,et al. α-Mangostin Alleviated Lipopolysaccharide Induced Acute Lung Injury in Rats by Suppressing NAMPT/NAD Controlled Inflammatory Reactions. Evidence-Based Complementary and

Alternative Medicine. 2018;(IF1.984)

1. Bin Zhang,Dongmei Shi, Xiangyu Zhang,et al. FK866 inhibits the epithelial-mesenchymal transition of hepatocarcinoma MHCC97-H cells. Oncology Letters. October 2018;(IF1.871)

2. Yang K, Yin Q, Mao Q, et l. Metabolomics analysis reveals therapeutic effects of α-mangostin on collagen-induced arthritis in rats by down-regulating nicotinamide phosphoribosyltransferase[J]. Inflammation, 2019, 42(2): 741-753.

参考文献：

1. Ying W. NAD⁺/NADH and NADP⁺/NADPH in cellular functions and cell death: regulation and biological consequences[J]. Antioxidants & redox signaling, 2008, 10(2): 179-206.

2. Gibon Y, Larher F. Cycling assay for nicotinamide adenine dinucleotides: NaCl precipitation and ethanol solubilization of the reduced tetrazolium[J]. Analytical biochemistry, 1997, 251(2): 153-157.

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