品牌 | SOLARBIO/索莱宝 | CAS | 详询 |
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分子式 | 详询 | 纯度 | 详询 |
分子量 | 详询 | 货号 | BC0315 |
规格 | 100管/48样 | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | 辅酶ⅠNAD(H)含量检测 | 应用领域 | 环保,化工,生物产业,农业,综合 |
辅酶Ⅰ NAD(H)含量检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
货号:BC0315
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
酸性提取液 | 液体25 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
碱性提取液 | 液体25 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体1.5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体4mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 液体0.7 mL×1支 | -20℃保存 |
试剂五 | 液体15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂六 | 液体20 mL×1瓶(自备) | 常温保存 |
NAD标准品 | 粉剂×1支 | -20℃保存 |
NADH标准品 | 粉剂×1支 | -20℃保存 |
溶液的配制:
1、试剂三:需要严格避光;
2、试剂六:19.2 mL乙醇和0.8 mL蒸馏水混合,备用;
3、NAD标准品:临用前加入1.5 mL蒸馏水,即2 µmol/mL,将其稀释为1.25 nmol/mL的NAD标准溶液备
用;
4、NADH标准品:临用前加入1.4 mL蒸馏水,即2 µmol/mL,将其稀释为1.25 nmol/mL的NADH标准溶液备用。
产品说明:
辅酶I包括还原型和氧化型两种形式,在生物氧化中起传递氢的作用。氧化型辅酶I又称烟*胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是脱氢酶的辅酶,它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给NAD,使之成为NADH(还原型辅酶I)。而NADH则会作为氢的载体,在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式,合成ATP。NAD(H)在机体内有重要的生理意义,与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病的发生密切相关。体内辅酶I含量降低会导致细胞损伤或衰亡。
分别用酸性和碱性提取液提取样本中NAD+和NADH,NADH通过PMS的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒,在570nm下检测吸光值,而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH,进一步采用MTT还原法检测。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤: 具体操作步骤详见“产品资料"附件
注意事项:
1、操作过程应避光。不可将试剂一、二、三混合后再加,必须分开加。
2、反应过程要注意避光。
3、当吸光值大于1时,建议稀释后测量。
实验实例:
NAD+的提取:称取约0.1g肌肉按照提取和测定步骤操作,用96孔板测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.507-0.2=0.307,ΔA标准1=A标准1-A空白=0.612-0.144=0.468,按样本质量计算NAD+ 含量得:NAD+ (nmol/g 质量)=1.25×ΔA测定÷ΔA标准1÷W=1.25×0.307÷0.468÷0.1=8.1998 nmol/g 质量。
NADH的提取:称取约0.1g肌肉按照提取和测定步骤操作,用96孔板测测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.183-0.077=0.106,ΔA标准2=A标准2-A空白=0.399-0.143=0.256,按样本质量计算NADH 含量得:NADH (nmol/g 质量)=1.25×ΔA测定÷ΔA标准2÷W=1.25×0.106÷0.256÷0.1=5.1758 nmol/g 质量。
NAD+的提取:称取约0.1g柳树叶,按照提取和测定步骤操作,用96孔板测测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.171-0.101=0.07,ΔA标准1=A标准1-A空白=0.612-0.144=0.468,按样本质量计算NAD+ 含量得:NAD+ (nmol/g 质量)=1.25×ΔA测定÷ΔA标准1÷W=1.25×0.07÷0.468÷0.1=1.8697 nmol/g 质量。
NADH的提取:称取约0.1g柳树叶,按照提取和测定步骤操作,用96孔板测测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.152-0.099=0.053,ΔA标准2=A标准2-A空白=0.399-0.143=0.256,按样本质量计算NADH 含量得:NADH (nmol/g 质量)=1.25×ΔA测定÷ΔA标准2÷W=1.25×0.053÷0.256÷0.1=2.5879 nmol/g 质量。
NAD+的提取:取0.1mL火鸡血清,按照提取和测定步骤操作,用96孔板测测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.120-0.071=0.049,ΔA标准1=A标准1-A空白=0.612-0.144=0.468,按液体体积计算NAD+ 含量得:NAD+含量(nmol/mL)=12.5×ΔA测定÷ΔA标准1=12.5×0.049÷0.468=1.3088 nmol/mL。
NADH的提取:取0.1mL马火鸡血清,按照提取和测定步骤操作,用96孔板测测得计算ΔA测定管= A测定-A对照=0.089-0.065=0.024,ΔA标准2=A标准2-A空白=0.399-0.143=0.256,按液体体积计算NADH 含量得:NADH含量(nmol/mL)=12.5×ΔA测定÷ΔA标准2=12.5×0.024÷0.256=1.1719 nmol/mL。
相关发表文献:
Xiaofen Fu,Pengsong Li,Lei Zhang,et al. Understanding the stress responses of Kluyveromyces marxianus after an arrest during high-temperature ethanol fermentation based on integration of RNA-Seq and metabolite data. Applied Microbiology and Biotechnology. March 2019;103(6) :2715–2729.(IF3.67)
Mengqing Tao,Jia Jiang,Lin Wang,et al. α-Mangostin Alleviated Lipopolysaccharide Induced Acute Lung Injury in Rats by Suppressing NAMPT/NAD Controlled Inflammatory Reactions. Evidence-Based Complementary and
Alternative Medicine. 2018;(IF1.984)
Bin Zhang,Dongmei Shi, Xiangyu Zhang,et al. FK866 inhibits the epithelial-mesenchymal transition of hepatocarcinoma MHCC97-H cells. Oncology Letters. October 2018;(IF1.871)
Yang K, Yin Q, Mao Q, et l. Metabolomics analysis reveals therapeutic effects of α-mangostin on collagen-induced arthritis in rats by down-regulating nicotinamide phosphoribosyltransferase[J]. Inflammation, 2019, 42(2): 741-753.
参考文献:
Ying W. NAD+/NADH and NADP+/NADPH in cellular functions and cell death: regulation and biological consequences[J]. Antioxidants & redox signaling, 2008, 10(2): 179-206.
Gibon Y, Larher F. Cycling assay for nicotinamide adenine dinucleotides: NaCl precipitation and ethanol solubilization of the reduced tetrazolium[J]. Analytical biochemistry, 1997, 251(2): 153-157.
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