过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒 微量法

过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC0205

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：液体置于试剂瓶内EP管中，使用前需先离心。

2、 检测工作液的配制：
A. 使用96孔UV板：取试剂二25 μL中加入5mL试剂一，充分混匀，作为工作液（约26T），现用现配；也可根据样本量按比例配制（提供1个15 mL空瓶）。
B. 使用微量石英比色皿：取试剂二25 μL中加入6.5mL试剂一，充分混匀，作为工作液（约34T），现用现配；也可根据样本量按比例配制（提供1个15 mL空瓶）。

产品说明：

CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的H₂O₂清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。

H₂O₂在240nm下有特征吸收峰，CAT能够分解H₂O₂，使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌、细胞或组织样本的制备：

a、细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

b、组织：按照组织质量（g）：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样本：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至240nm，蒸馏水调零。

2、 测定前将CAT检测工作液在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。

3、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和190μL工作液，立即混匀并计时，记录240nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。计算ΔA=A1-A2。

三、CAT活性计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）CAT活力的计算：

单位的定义：每mL血清（浆）每分钟催化1μmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/mL)= [ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁶]÷V样÷T=459×ΔA

2、组织、细菌或细胞中CAT活力计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化1μmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁶]÷(Cpr×V样) ÷T=459×ΔA÷Cpr

（2）按样本质量计算：

单位的定义：每g组织每分钟催化1μmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/g 质量)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁶]÷（V样÷V样总×W）÷T=459×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化1μmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁶]÷（V样÷V样总×500）÷T =0.917×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：H₂O₂摩尔消光系数，43.6 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，500万；10⁶：单位换算系数，1mol=10⁶μmol。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、血清（浆）CAT活力的计算：

单位的定义：每mL血清（浆）在反应体系中每分钟催化1μmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/mL)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁶]÷V样÷T=764.5×ΔA

2、组织、细菌或细胞中CAT活力计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1μmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁶]÷(Cpr×V样) ÷T =764.5×ΔA÷Cpr

（2）按样本质量计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化1μmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/g 质量)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁶]÷（V样÷V样总×W）÷T=764.5×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1μmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁶]÷（V样÷V样总×500）÷T=1.529×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：H₂O₂摩尔消光系数，43.6 L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，500万；10⁶：单位换算系数，1mol=10⁶μmol。

注意事项：

如果反应液有大量气泡产生，将样本用蒸馏水稀释后再进行测定。

相关发表文献：

[1] Zhang Z, Liu H, Sun C, et al. A C2H2 zinc-finger protein OsZFP213 interacts with OsMAPK3 to enhance salt tolerance in rice[J]. Journal of plant physiology, 2018, 229: 100-110.

[2] Yin Y J, Chen C J, Guo S W, et al. The fight against Panax notoginseng root-rot disease using zingiberaceae essential oils as potential weapons[J]. Frontiers in plant science, 2018, 9: 1346.

[3] Yang Y, Li J, Wei C, et al. Amelioration of nonalcoholic fatty liver disease by swertiamarin in fructose-fed mice[J]. Phytomedicine, 2019, 59: 152782.

[4] Chen G, Jia Z, Wang L, et al. Effect of acute exposure of saxitoxin on development of zebrafish embryos (Danio rerio) [J]. Environmental Research, 2020: 109432.

参考文献：

[1] Catalase in vitro. [J]. Methods Enzymol, 105:121-126.

[2] Johansson L H, Borg L A H. A spectrophotometric method for determination of catalase activity in small tissue samples[J]. Analytical biochemistry, 1988, 174(1): 331-336.

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