品牌 | SOLARBIO/索莱宝 | CAS | 详询 |
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分子式 | 详询 | 纯度 | 详询 |
分子量 | 详询 | 货号 | BC0060 |
规格 | 50管/24样 | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | Na+K+- ATP酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中,可催化ATP水解生成 | 应用领域 | 环保,化工,生物产业,农业,综合 |
Na+K+-ATP酶活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
货号:BC0060
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体4 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 粉剂×2支 | -20℃保存 |
试剂四 | 液体2 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂五 | 液体3mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂六 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂七 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂八 | 液体15 mL×1瓶 | 常温保存 |
标准品 | 液体1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制:
试剂三:用时取1支加1 mL蒸馏水,现用现配。用不完的试剂-20℃分装保存一周。
试剂六:用时加入15 mL蒸馏水,溶解后2-8℃保存两周。
试剂七:用时加入15 mL蒸馏水,溶解后2-8℃保存两周。
标准品:10 μmol/mL标准磷贮备液。将标准品20倍稀释,即取0.1 mL标准品加1.9 mL蒸馏水充分混匀,配成0.5 μmol/mL标准磷应用液。
定磷剂的配制:按H2O:试剂六:试剂七:试剂八=2:1:1:1(体积比)的比例配制,配好的定磷剂应为浅黄色。若变色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂根据实验用量现用现配。
注意:配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。
产品说明:
Na+K+- ATP酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中,可催化ATP水解生成ADP和无机磷。
Na+K+-ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷,通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性。
ATP ADP + Pi
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌、细胞或组织样本的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每500万细菌或细胞加入1mL试剂一,超声波破碎细菌或细胞(功率200w,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:称取约0.1g组织,加入1mL试剂一进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上,调节波长至660nm,蒸馏水调零。
2、酶促反应(在EP管中加入下列试剂)
试剂名称 | 对照管 | 测定管 |
试剂一(μL) | 130 | 90 |
试剂二(μL) | 80 | 80 |
试剂三(μL) | 40 | 40 |
试剂四(μL) | - | 40 |
样本(μL) | - | 200 |
混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)准确水浴10min | ||
试剂五(μL) | 50 | 50 |
样本(μL) | 200 | - |
混匀,4000g,常温离心10min,取上清液 |
3、定磷(在1.5mL EP管中依次加入下列试剂)
试剂名称 | 空白管 | 标准管 | 对照管 | 测定管 |
0.5μmol/mL标准磷应用液(μL) | - | 100 | - | - |
上清液(μL) | - | - | 100 | 100 |
蒸馏水(μL) | 100 | - | - | - |
定磷试剂(μL) | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
混匀,40℃水浴10 min,冷却至室温,在660nm处比色。分别记为A空白、A标准、A对照、A测定。每个测定管需设一个对照管,标准管和空白管只需测1-2次。 |
三、Na+K+-ATP酶活计算
1、血清(浆)Na+K+-ATPase活力的计算:
定义:规定每小时每毫升血清(浆)中Na+K+- ATP酶分解ATP产生1μmoL无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP酶活力(U/mL)= C标×(A测定-A对照)÷(A标准-A空白)×V总÷V样÷T
=7.5×(A测定-A对照)÷(A标准-A空白)
2、组织、细菌或细胞中Na+K+- ATPase活力的计算:
(1)按蛋白浓度计算:
定义:规定每小时每毫克组织蛋白中Na+K+- ATP酶分解ATP产生1μmoL无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP酶活力(U/mg prot)= C标×(A测定-A对照)÷(A标准-A空白)×V总÷(Cpr×V样)÷T
=7.5×(A测定-A对照)÷(A标准-A空白)÷Cpr
(2)按样本质量计算:
定义:规定每小时每克组织中Na+K+-ATP酶分解ATP产生1μmoL无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP酶活力(U/g 质量)= C标×(A测定-A对照)÷(A标准-A空白)×V总÷(V样÷V样总×W)÷T
=7.5×(A测定-A对照)÷(A标准-A空白)÷W
(3)按细菌或细胞数量计算:
定义:规定每小时每1万个细菌或细胞中Na+K+-ATP酶分解ATP产生1μmoL无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP酶活力(U/104 cell)= C标×(A测定-A对照)÷(A标准-A空白)×V总÷(V样÷V样总×500)÷T
=0.015×(A测定-A对照)÷(A标准-A空白)
C标:标准管浓度,0.5μmol/mL;V总:酶促反应总体积,0.5mL;V样:加入样本体积,0.2mL;V样总:加入试剂一体积,1mL;T:反应时间,1/6小时;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
注意事项:
1、由于每一个样都必须做对照,本试剂盒50管保证测 24份Na+K+-ATP酶。
2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。
实验实例:
取0.1g小鼠心脏加入1mL试剂一进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清置冰上,之后按照测定步骤操作,测得计算A测定=1.216,A对照=0.842,A标准=0.398,A空白管=0.004,按样本质量计算酶活得:
Na+K+-ATP酶活力(U/g 质量)=7.5×(A测定-A对照)÷(A标准-A空白)÷W=71.19 U/g 质量。
取0.1g稗草加入1mL试剂一进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清置冰上,之后按照测定步骤操作,测得计算A测定=0.474,A对照=0.403,A标准=0.398,A空白=0.004,按样本质量计算酶活得:
Na+K+-ATP酶活力(U/g 质量)=7.5×(A测定-A对照)÷(A标准-A空白)÷W=13.52 U/g 质量。
取200μL小鼠血浆稀释2倍,直接检测,A测定管=0.958,A对照=0.906,A标准=0.398,A空白=0.004,按液体体积计算酶活得:
Na+K+-ATP酶活力(U/mL)=7.5×(A测定-A对照)÷(A标准-A空白)×2(稀释倍数)=1.98 U/mL。
相关发表文献:
Fangzhou Chen,Ying Zhao,Huizhao Chen,et aL. MicroRNA-98 reduces amyLoid β-protein production and improves oxidative stress and mitochondriaL dysfunction through the Notch signaLing pathway via HEY2 in ALzheimer's disease mice. InternationaL JournaL of MoLecuLar Medicine. October 2018;(IF2.928)
Wanxiu Cao,Jing Li,Yaoxian Chin,et aL. Transcriptomic anaLysis reveaLs effects of fucoxanthin on intestinaL
gLucose transport. JournaL of FunctionaL Foods. October 2018;(IF3.197)
Li M, Jiang C, Zhang Y, et al. Activities of Amphioxus GH-like protein in osmoregulation: insight into origin of vertebrate GH family[J]. International journal of endocrinology, 2017, 2017.
参考文献:
[1] Luo L G, MacLean D B. Effects of thyroid hormone on food intake, hypothalamic Na/K ATPase activity and ATP content[J]. Brain research, 2003, 973(2): 233-239.
[2] Cornelius F. Modulation of Na, K-ATPase and Na-ATPase activity by phospholipids and cholesterol. I. Steady-state kinetics[J]. Biochemistry, 2001, 40(30): 8842-8851.
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