辅酶ⅠNAD（H）含量试剂盒

辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒 

产品简介 ：
    NAD(H)是糖酵解和 TCA 循环的主要氢受体， 生成的 NADH 经呼吸电子链传递把电子交给氧， 在合成 ATP的同时，形成大量的 ROS，同时 NADH 再生为 NAD。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD 比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。
    较高的 NAD(H)及 NADH/NAD 比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态，NADH/NAD 比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循环。另外，NAD 降解产物具有非常重要的调控作用。
NAD 和 NADH 在 254 nm 下有吸收峰，利用高效液相色谱法在相应波长下测定其含量。

试验中所需的仪器和试剂：
    高效液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、针头式过滤器（水系，50 个，0.22µm） 、滤膜（水系和有机系各 2 个，0.45µm） 、C18 柱（4.6 ×150 mm） 、可调式移液器、样品瓶（50 个，2mL） 、乙腈（120 mL） 、甲醇（色谱级，300 mL） 、蒸馏水
注：若用自动进样器，需要样品瓶，测定时将不少于 1mL 的样品或标准品加入样品瓶中。无自动进样器，需手动进样时，不需要样品瓶，用进样针将不少于 20ul 的样品或标准品打入进样阀。

产品内容 ：
    试剂一：粉剂 1×1 瓶，粉剂 2×1 瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂 1 和粉剂 2 溶解后倒入容量瓶中，用蒸馏水定容 100mL，形成 NAD 和 NADH 提取液（注：试剂瓶中的粉剂要冲洗干净），4℃保存3 个月；
    试剂二：粉剂 1×1 瓶，粉剂 2×1 瓶，粉剂 3×1 瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂 1、粉剂 2 和粉剂 3 溶解后倒入容量瓶中，用蒸馏水定容 1000mL，形成流动相缓冲液基质（注：试剂瓶中的粉剂要冲洗干净）, 4℃保存 3 个月。
    试剂三：NAD 标准品 5mg×1 支，-20℃保存。加入 1mL 试剂一，配成 5mg/mL 溶液，现配现用，用不完的试剂-20℃保存。
    试剂四：NADH 标准品 5 mg×1 支，-20℃保存。加入 1mL 试剂一，配成 5mg/mL 溶液，现配现用，用不完的试剂-20℃保存。

操作步骤 ：
一 、 实验前的准备工作 ：
    1. 将双蒸水 1000 mL、流动相缓冲液基质 1000 mL、甲醇 300 mL 和乙腈 120 mL 用 0.45µm 的滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。（注：双蒸水和缓冲液基质用水系滤膜抽滤，乙腈用有机系滤膜抽滤）。
    2. 流动相的配制：将抽滤完毕的流动相缓冲液基质 1000 mL 与乙腈配比为 9：1（v/v），即取 900mL缓冲液基质与 100 mL 乙腈混合。[每个样品需要约 12mL 流动相，流动相用量（mL）=12mL×样品数量+跑基线用量（约 50mL），流动相的用量请根据样品数量用多少配多少]。
    3. 将抽滤完毕的甲醇和双蒸水配比成 100%的甲醇， 10%的甲醇，双蒸水各 250 mL。
    4. 将 2 和 3 中的溶剂超声 30 分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱。
二 、 辅酶 NAD(H) Ⅰ 的提取 ：
    组织的处理：准确称取组织重量，按重量体积比（g/mL）加 9 倍试剂一，提取 NAD 和 NADH，制成10%匀浆。20000 g/min 离心 30 min，取上清液用 0.22µm 水系针头式过滤器过滤后待测，同时测定组织蛋白含量。
    细胞处理：收集于 60 mL 细胞，离心菌体经高压冷冻干燥 12 h 后，加入 2 mL 试剂一。超声破壁细胞(950 W，30%，15 min，工作 1 s，间隔 2 s)，再经 10,000r 4℃高速离心 40s，上清用 0.22µm 水系微孔滤膜过滤后直接上柱检测。

三 、 辅酶 NAD(H) Ⅰ 含量测定操作步骤 ：
     1. 开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开 empower 软件，在方法组中设置进样量 20 µL，流速 0.8mL/min，保留时间 15min，检测波长 254nm,设置完毕保存方法组。
     2. 用 100%的甲醇、10%的甲醇、双蒸水按甲醇浓度从大到小的顺序洗色谱柱 30min。
     3. 用流动相洗柱子，待基线稳定后开始加样。
     4. 加入标准品 20 µL，在 15min 内可分离 NAD 和 NADH， NAD 的保留时间在 3min 左右，NADH 的保留时间在 7min 左右（柱子不同，保留时间有差异），计算不同浓度的 NAD 和 NADH 标准品的峰面积。
     5. 加入样品 20 µL，在相应保留时间处检测 NAD 和 NADH 的峰面积。

辅酶 NAD(H) Ⅰ 含量的计算 ：
1. NAD  含量的计算
NAD 标准曲线的绘制：
    将 5mg/ml 的 NAD 标准品用双蒸水分别稀释成 110 µg/ml、80 µg/ml、50 µg /ml、和 20 µg /ml 的 NAD标准品溶液，计算不同标准品溶液的峰面积。
计算标准曲线公式为: y = 25069χ- 26754（χ 为 NAD 浓度，µ g/ml；y 为峰面积）
推出：χ=（y + 26754）÷25069（χ 为 NAD 浓度，µg/ml；y 为峰面积）
NAD 含量（µg/mg prot）=（样品峰面积+26754）÷25069÷蛋白浓度（mg/mL）
NAD 含量（µg/g mass）=（样品峰面积+26754）÷25069÷样本鲜重（g/mL）
2. NADH 含量的计算
NADH 标准曲线的绘制：
    将 5mg/ml 的 NADH 标准品用双蒸水分别稀释成 200 µg/ml、 150 µg/ml、 100 µg/ml 和 50 µg/ml 的 NADH标准品溶液，计算不同标准品溶液的峰面积。
计算标准曲线公式为: y = 13275χ+35717（χ 为 NADH 浓度，µ g/ml；y 为峰面积）
推出：χ=（y – 35717）÷13275（χ 为 NADH 浓度，µ g/ml；y 为峰面积）
NADH 含量（µg/mg prot）=（样品峰面积 - 35717）÷13275÷蛋白浓度（mg/mL）
NADH 含量（µg/g 鲜重）=（样品峰面积 - 35717）÷13275÷样本鲜重（g/mL）
注：标准品的稀释倍数要根据样品中 NAD 和 NADH 浓度确定，样品中 NAD 和 NADH 的峰面积必须落在不同浓度的 NAD 和 NADH 标准品的峰面积之内，该标准曲线紧供参考。

相关文献：

《Understanding the stress responses of Kluyveromyces marxianus after an arrest during high-temperature ethanol fermentation based on integration of RNA-Seq and metabolite data》 作者:Xiaofen Fu， Pengsong Li，Lei Zhang， Shizhong Li 期刊:Applied Microbiology and Biotechnology 影响因子:3.67 PMID:30673809
《α-Mangostin Alleviated Lipopolysaccharide Induced Acute Lung Injury in Rats by Suppressing NAMPT/NAD Controlled Inflammatory Reactions》 作者:Mengqing Tao,1Jia Jiang,Lin Wang,Yan Li, Qingcheng Mao, Jiyang Dong, and Jian Zuo 期刊:Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 影响因子:1.984 PMID:30405740
《FK866 inhibits the epithelial?mesenchymal transition of hepatocarcinoma MHCC97?H cells》 作者:Bin Zhang Dongmei Shi Xiangyu Zhang Guanzhao Liang Weida Liu Sen Qiao 期刊:Oncology Letters 影响因子:1.871 PMID:
《Involvement of the two l-lactate dehydrogenase in development and pathogenicity in Fusarium graminearum》 作者:Wenchan ChenLingling WeiYu ZhangDongya ShiWeichao RenZhihui ZhangJin WangWenyong ShaoXiali LiuChangjun ChenEmail authorQingli Gao 期刊:Curr Genet 影响因子:3.464 PMID:30474697
《Modulating acetate ester and higher alcohol production in Saccharomyces cerevisiae through the cofactor engineering》 作者:Kun-Qiang Hong,Xiao-Meng Fu,Sheng-Sheng Dong,Dong-guang Xiao,Jian Dong 期刊:J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 影响因子:2.993 PMID:30969383
《Metabolomics Analysis Reveals Therapeutic Effects of α-Mangostin on Collagen-Induced Arthritis in Rats by Down-regulating Nicotinamide Phosphoribosyltransferase》 作者:Kui Yang,Qin Yin,Qingcheng Mao,Sheng Dai,Lin Wang,Jiyang Dong,Jian Zuo 期刊:Inflammation 影响因子:2.939 PMID:30484004
 

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