辅酶ⅠNAD（H）含量试剂盒

辅酶Ⅰ NAD(H)含量检测试剂盒说明书

可见分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号: BC0310

规格: 50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、试剂三：需要严格避光；

2、试剂六：72 mL乙醇和3 mL蒸馏水混合，备用；

3、NAD标准品：临用前加入1.5 mL蒸馏水，即2 µmol/mL，将其稀释为1.25 nmol/mL的NAD标准溶液备用；

4、NADH标准品：临用前加入1.4 mL蒸馏水，即2 µmol/mL，将其稀释为1.25 nmol/mL的NADH标准溶液备用。

产品说明：

辅酶I包括还原型和氧化型两种形式，在生物氧化中起传递氢的作用。氧化型辅酶I又称烟酰*腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是脱氢酶的辅酶，它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给NAD，使之成为NADH（还原型辅酶I）。而NADH则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式，合成ATP。NAD(H)在机体内有重要的生理意义，与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病的发生密切相关。体内辅酶I含量降低会导致细胞损伤或衰亡。

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD⁺和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在570nm下检测吸光值， NAD⁺可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、NAD⁺和NADH的提取（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、血清（浆）中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：取0.1mL血清（浆），加入0.5mL酸性提取液，煮沸5min（盖紧，以防止水分散失），冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min；取上清200µL，加入等体积碱性提取液；混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。

NADH的提取：取0.1mL血清（浆），加入0.5mL碱性提取液，煮沸 5min（盖紧，以防止水分散失），冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min，取上清200µL，加入等体积酸性提取液；混匀，10000g 4℃离心10min，取上清,冰上保存待测。

2、组织中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：称取约0.1g组织，加入0.5mL酸性提取液，冰浴研磨，煮沸5min（盖紧，以防止水分散失），冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min，取上清200µL，加入等体积碱性提取液混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。

NADH的提取：称取约0.1g组织，加入0.5mL碱性提取液，冰浴研磨，煮沸5min（盖紧，以防止水分散失），冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min，取上清200µL，加入等体积酸性提取液混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。

3、细胞或细菌中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：收集500万细胞或细菌，加入0.5mL酸性提取液，超声波破碎1min（功率200W，超声2s，停1s），煮沸5min（盖紧，以防止水分散失），冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min，取上清液200μL至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。

   NADH的提取：收集500万细胞或细菌，加入0.5mL碱性提取液，超声波破碎1min（功率200W，超声2s，停1s），煮沸5min（盖紧，以防止水分散失），冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min，取上清液200μL至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30分钟以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。

2、 操作表（在1.5mL棕色EP管中按下表依次加样）

混匀， 570nm下比色，读取吸光值ΔA测定=A测定管-A对照管，NAD标准管的记为ΔA标准1=A标准管1-A空白管。NADH标准管的记为ΔA标准2=A标准管2-A空白管。（空白管只需做1-2次）

三、NAD⁺含量的计算

1、血清（浆）中NAD⁺含量计算

NAD⁺（nmol/mL）=ΔA测定÷（ΔA标准1÷C标）×V提取÷V血清=12.5×ΔA测定÷ΔA标准1

2、组织、细菌、细胞中NAD⁺含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NAD⁺ （nmol/mg prot）=ΔA测定÷（ΔA标准1÷C标）×V提取÷(V提取×Cpr)= 1.25×ΔA测定÷ΔA标准1 ÷ Cpr

(2)按样本质量计算

NAD⁺（nmol/g 质量）=ΔA测定÷（ΔA标准1÷C标）×V提取÷W= 1.25×ΔA测定÷ΔA标准1÷W

(3)按细菌或细胞数量计算

NAD⁺（nmol/10⁴ cell）=ΔA测定÷（ΔA标准1÷C标）×V提取÷500=0.0025×ΔA测定÷ΔA标准1

四、NADH含量的计算

1、 血清（浆）中NADH含量计算

NADH（nmol/mL）=ΔA测定÷（ΔA标准2÷C标）×V提取÷V血清=12.5×ΔA测定÷ΔA标准2

2、组织中NADH含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADH（nmol/mg prot）=ΔA测定÷（ΔA标准2÷C标）×V提取÷(V样品×Cpr)=1.25×ΔA测定÷ΔA标准2÷ Cpr

(2)按样本质量计算

NADH（nmol/g 质量）=ΔA测定÷（ΔA标准2÷C标）×V提取÷W=1.25×ΔA测定÷ΔA标准2÷W

(3)按细菌或细胞数量计算

NADH（nmol/10⁴ cell）=ΔA测定÷（ΔA标准2÷C标）×V提取÷500=0.0025×ΔA测定÷ΔA标准2

C标：NAD或NADH标准溶液的浓度，1.25nmol/mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；V提取：加入提取液总体积，1mL；V血清：提取时加入的血清体积，0.1mL；W：样本质量，g；500：500万个细胞。

注意事项：

1、操作过程应避光。不可将试剂一、二、三混合后再加，必须分开加。

2、反应过程要注意避光。

3、当吸光值大于1时，建议稀释后测量，计算公式中应当乘以稀释倍数。

实验实例：

1、 NAD⁺的提取：称取约0.1g肺，按照提取和测定步骤操作，测得计算ΔA测定=A测定-A对照=0.341-0.321=0.02，ΔA标准1=A标准1-A空白=1.045-0.246=0.799，按样本质量计算NAD⁺ 含量得：NAD⁺ (nmol/g 质量）=1.25×ΔA测定÷ΔA标准1÷W=1.25×0.02÷0.799÷0.1=0.3129 nmol/g 质量。

NADH的提取：称取约0.1g肺，按照提取和测定步骤操作，测得计算ΔA测定=A测定-A对照=0.2-0.136=0.064，ΔA标准2=A标准2-A空白=0.687-0.252=0.435，按样本质量计算NADH 含量得：NADH(nmol/g 质量）=1.25×ΔA测定÷ΔA标准2÷W=1.25×0.064÷0.435÷0.1=1.839 nmol/g 质量。

2、 NAD⁺的提取：称取约0.1g柳树叶，按照提取和测定步骤操作，测得计算ΔA测定=A测定- A对照=0.259-0.129=0.13，ΔA标准1=A标准1-A空白=1.045-0.246=0.799，按样本质量计算NAD⁺ 含量得：NAD⁺ (nmol/g 质量）= 1.25×ΔA测定÷ΔA标准1÷W=1.25×0.13÷0.799÷0.1=2.03379 nmol/g 质量。

NADH的提取：称取约0.1g柳树叶，按照提取和测定步骤操作，测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.194-0.086=0.108，ΔA标准2=A标准2-A空白=0.687-0.252=0.435，按样本质量计算NADH 含量得：NADH  (nmol/g 质量）=1.25×ΔA测定÷ΔA标准2÷W=1.25×0.108÷0.435÷0.1=3.1034 nmol/g 质量。

3、 NAD⁺的提取：称取约0.1mL马血清，按照提取和测定步骤操作，测得计算ΔA测定=A测定-A对照=0.091-0.061=0.03，ΔA标准1=A标准1-A空白=1.045-0.246=0.799，按液体体积计算NAD⁺ 含量得：NAD⁺含量(nmol/mL）=12.5×ΔA测定÷ΔA标准1=12.5×0.03÷0.799=0.4693 nmol/mL。

NADH的提取：称取约0.1mL马血清，按照提取和测定步骤操作，测得计算ΔA测定=A测定-A对照=0.126-0.1=0.026，ΔA标准2=A标准2-A空白=0.687-0.252=0.435，按液体体积计算NADH 含量得：NADH含量(nmol/mL）=12.5×ΔA测定÷ΔA标准2=12.5×0.026÷0.435=0.7471 nmol/mL。

相关发表文献：

[1] Xiaofen Fu,Pengsong Li,Lei Zhang,et al. Understanding the stress responses of Kluyveromyces marxianus after an arrest during high-temperature ethanol fermentation based on integration of RNA-Seq and metabolite data. Applied Microbiology and Biotechnology. March 2019;103(6) :2715–2729.(IF3.67)

[2] Mengqing Tao,Jia Jiang,Lin Wang,et al. α-Mangostin Alleviated Lipopolysaccharide Induced Acute Lung Injury in Rats by Suppressing NAMPT/NAD Controlled Inflammatory Reactions. Evidence-Based Complementary and

Alternative Medicaine. 2018;(IF1.984)

[3] Bin Zhang,Dongmei Shi, Xiangyu Zhang,et al. FK866 inhibits the epithelial-mesenchymal transition of hepatocarcinoma MHCC97-H cells. Oncology Letters. October 2018;(IF1.871)

[4] Yang K, Yin Q, Mao Q, et al. Metabolomics analysis reveals therapeutic effects of α-mangostin on collagen-induced arthritis in rats by down-regulating nicotinamide phosphoribosyltransferase[J]. Inflammation, 2019, 42(2): 741-753.

参考文献：

[1] Ying W. NAD⁺/NADH and NADP⁺/NADPH in cellular functions and cell death: regulation and biological consequences[J]. Antioxidants & redox signaling, 2008, 10(2): 179-206.

[2] Gibon Y, Larher F. Cycling assay for nicotinamide adenine dinucleotides: NaCl precipitation and ethanol solubilization of the reduced tetrazolium[J]. Analytical biochemistry, 1997, 251(2): 153-157.

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