辅酶ⅡNADP（H）含量试剂盒

辅酶ⅡNADP（H）含量试剂盒

产品简介 ：
    NADP + 和 NADPH 含量测定可以计算 NADP（NADPH + NADP + )含量和 NADPH/NADP + 比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。 NADPH/NADP + 比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。
    分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP + 和 NADPH。NADPH 通过 PMS 的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm 下检测吸光值，从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原NADP + 为 NADPH，从而检测 NADP + 含量。

试验中所需的仪器和试剂：
   可见分光光度计或酶标仪、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿或酶标板、研钵、冰和蒸馏水。

产品内容 ：

酸性提取液：50mL×1 瓶，4℃保存；
碱性提取液：50mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：基质缓冲液 15 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 支，-20 ℃保存，用时加入 4mL 双蒸水，混匀；
试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存，用时加入 4mL 双蒸水，混匀；
试剂四：粉剂×1 支，4 ℃保存，用时加入 4mL 双蒸水，混匀；
试剂五：液体 1.8mL×1 支，4 ℃保存；
试剂六：液体 30mL×1 瓶，4 ℃保存；
试剂七：液体 50mL×1 瓶，4 ℃保存。

操作步骤 ：
一 、NADP  和 和 NADPH  的提取 ：
1、血清（浆）中 NADP 和 NADPH 的提取：
    取 0.1mL 血清（浆），加入 0.9mL 酸性提取液，煮沸 5min；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心 10min；

    取上清液另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和；10000g 4℃离心 10min，取上清液冰上保存供测定 NADP + 含量。
    取 0.1mL 血清（浆），加入 0.9mL 碱性提取液，煮沸 5min,冰浴中冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清液另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，10000g 4℃离心 10min，取上清液冰上保存供测定 NADPH 含量。
2、组织中 NADP 和 NADPH 的提取：
    称取约 0.1g 组织， 加入 0.9mL 酸性提取液， 冰浴研磨， 煮沸 5min， 冰浴中冷却后， 10000g 4℃离心 10min，取上清液另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，10000g 4℃离心 10min，取上清液冰上保存供测定 NADP + 含量。
    称取约 0.1g 组织， 加入 0.9mL 碱性提取液， 冰浴研磨， 煮沸 5min， 冰浴中冷却后， 10000g 4℃离心 10min，取上清液另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，10000g 4℃离心 10min，取上清液冰上保存供测定 NADPH 含量。
3、细胞或细菌中 NADP 和 NADPH 的提取：
    先收集 400-500 万细胞或细菌到离心管内，弃上清，加入 0.9mL 酸性提取液，超声波破碎 1min（强度20％，超声 2s，停 1s），煮沸 5min，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min，取上清液另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，10000g 4 ℃离心 10min，取上清液冰上保存供测定 NADP + 含量。
    先收集 400-500 万细胞或细菌到离心管内，弃上清，加入 0.9mL 碱性提取液，超声波破碎 1min（强度20％，超声 2s，停 1s），煮沸 5min，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min，取上清液另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，10000g 4 ℃离心 10min，取上清液冰上保存供测定 NADPH 含量。

二 、 测定步骤( 在 在 1.5mLEP  管中按下表依次加样 ） ：

混匀，570nm 下比色。

注意事项
    1、若用比色皿测，沉淀用试剂七溶解后必须立即测。好加一个测一个。
    2、若用酶标板测，也必须在测定时再加试剂七，加入 1000µL 试剂七溶解沉淀，混匀后，取 300µL 酶标板中，立即测定。
    3、不可将试剂一、二、三和四混合后再加，必须分开加。

三 、NADP + 和 和 NADPH  含量的计算 ：
  （一）NADP+含量的计算
1、血清（浆）中 NADP + 含量计算
   NADP + 含量(µmol/L）= (测定管 OD 值-0.047）×376
2、组织中 NADP + 含量计算
   (1)按样本蛋白浓度计算
NADP + (µmol/g prot）= (测定管 OD 值-0.047）×37.6÷样本蛋白浓度（g/L）
   (2)按样本鲜重计算
NADP + (µmol/g mass）= (测定管 OD 值-0.047）×37.6÷样本鲜重（g/L）
3、细胞或细菌中 NADP + 含量计算
   (1)按样本蛋白浓度计算
NADP + (µmol/g prot）= (测定管 OD 值-0.047）×37.6÷样本蛋白浓度（g/L）
   (2)按细菌或细胞密度计算
NADP + (µmol/10 4 cell）= (测定管 OD 值-0.047）×37.6÷细菌或细胞（10 4 cell /L）
（二）NADPH 含量的计算
1、血清（浆）中 NADPH 含量计算
   NADPH 含量(µmol/L）= (测定管 OD 值-0.047）×855
2、组织中 NADPH 含量计算
   (1)按样本蛋白浓度计算
    NADPH (µmol/g prot）= (测定管 OD 值-0.047）×85.5÷样本蛋白浓度（g/L）
   (2)按样本鲜重计算
   NADPH (µmol/g mass）= (测定管 OD 值-0.047）×85.5÷样本鲜重（g/L）
3、细胞或细菌中 NADPH 含量计算
   (1)按样本蛋白浓度计算
   NADPH (µmol/g prot）= (测定管 OD 值-0.047）×85.5÷样本蛋白浓度（g/L）
   (2)按细菌或细胞密度计算
   NADPH (µmol/10 4 cell）= (测定管 OD 值-0.047）×85.5÷细菌或细胞密度（10 4  cell /L）。

相关文献：

《Understanding the stress responses of Kluyveromyces marxianus after an arrest during high-temperature ethanol fermentation based on integration of RNA-Seq and metabolite data》 作者:Xiaofen Fu， Pengsong Li，Lei Zhang， Shizhong Li 期刊:Applied Microbiology and Biotechnology 影响因子:3.67 PMID:30673809
 

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