辅酶ⅡNADP(H)含量检测试剂盒

辅酶II NADP(H)含量检测试剂盒（MTT显色法）说明书
可见分光光度法
货号：BC1100
规格：50T/24S
产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前加入6mL蒸馏水充分混匀，溶解后2-8℃保存4周。

2. 试剂四：临用前将试剂四A溶解到试剂四B中，溶解后分装保存，避免反复冻融，-20℃保存4周。

3. NADP标准品：临用前加入 1.27 mL 蒸馏水，即 5 µmol/mL，-20℃可以保存2周。

4. NADPH标准品：临用前加入 1.2 mL 蒸馏水，即 5 µmol/mL，-20℃可以保存2周。

产品说明：
辅酶Ⅱ NADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP⁺和 NADPH 含量测定可以计算 NADP（NADPH + NADP⁺)含量和 NADPH/NADP⁺比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP⁺比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在PPP途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP⁺和NADPH。NADPH通过PMS的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm下检测吸光值，从而测定 NADPH 含量。利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原NADP⁺为NADPH，从而检测NADP⁺含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器、超声破碎仪、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件

注意事项：

1. 如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三按比例配成混合液。

2. 反应过程中注意避光。

3. 由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒50管可以测定24个NADP⁺或NADPH。

1. 如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

实验实例：

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2. NADP⁺的测定：称取 0.1g 绿萝叶片，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定= A₂- A₁=0.092-0.036=0.056，标准曲线y₁=0.531x+0.0266，根据标曲得出x₁=0.055，NADP⁺含量得：NADP⁺ (nmol/g 质量）= x₁÷W=0.55 nmol/g 质量。

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NADPH的测定：称取 0.1g 绿萝叶片，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定=A测定-A对照= A₂’- A₁’=0.046-0.012=0.034，标准曲线y₂=0.332x+0.0136，根据标曲得出x₂=0.061，NADPH含量得：NADPH (nmol/g 质量）= x₂÷W=0.614 nmol/g 质量。

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2. NADP⁺的测定：称取 0.1g 大兔肝脏，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定= A₂- A₁=0.217-0.108=0.109，标准曲线y₁=0.531x+0.0266，根据标曲得出x₁=0.155，NADP⁺含量得：NADP⁺ (nmol/g 质量）= x₁÷W=1.55 nmol/g 质量。

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NADPH的测定：称取0.1g 大兔肝脏，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定=A测定-A对照= A₂’- A₁’=0.085-0.008=0.077，标准曲线y₂=0.332x+0.0136，根据标曲得出x₂=0.191，NADPH含量得：NADPH (nmol/g 质量）= x₂÷W=1.91 nmol/g 质量。

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2. NADP⁺的测定：取0.1mL马血清，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定= A₂- A₁=0.055-0.026=0.029，标准曲线y₁=0.531x+0.0266，根据标曲得出x₁=0.005，NADP⁺含量得：NADP⁺ （nmol/mL）= 11 x₁=0.050 nmol/mL。

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NADPH的测定：取0.1mL马血清，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定=A测定-A对照= A₂’- A₁’=0.028-0.012=0.016，标准曲线y₂=0.332x+0.0136，根据标曲得出x₂=0.007，NADPH含量得：NADPH（nmol/mL）=11 x₂=0.080 nmol/mL。
标准溶液稀释表
NADP⁺标准品稀释表                                      NADPH 标准品稀释表

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