γ-谷氨酰半*氨酸连接酶测试盒 微量法

γ-谷氨酰半*氨酸连接酶（GCL）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC1215
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二B：临用前加2 mL蒸馏水充分震荡溶解，用不完的试剂-20℃分装保存4周，禁止反复冻融；

2. 试剂二的配制：临用前根据样本量按试剂二A：试剂二B=260μL：104μL（共364μL，7T）的比例配制，现用现配，当天用完。

3. 试剂三：临用前加5 mL蒸馏水充分震荡溶解，2-8℃可以保存4周；

4. 试剂五：临用前加入5 mL蒸馏水溶解，用不完的试剂2-8℃保存2周；

5. 试剂六：临用前加入5 mL蒸馏水溶解，用不完的试剂2-8℃保存2周；

6. 工作液的配制：临用前根据样本量按试剂五：试剂六：试剂七=0.1mL：0.1mL：0.1mL（共0.3mL，3T）的比例配制，配好的工作液应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，限当天使用。（注意：配制工作液最好使用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。）

7. 标准品：10 μmol/mL磷标准溶液。

8. 0.1μmol/mL磷标准溶液的配制：临用前取0.1mL 10 μmol/mL标准液和0.9mL蒸馏水混合，配制浓度为1 μmol/mL；再取0.1mL 1 μmol/mL标准液和0.9mL蒸馏水混合配制成0.1μmol/mL磷标准溶液使用。

产品说明：
GCL（glutamate cysteine ligase）是GSH合成的限速酶，GSH对GCL有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节，如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性高低对GSH含量和GSH/*比值有重要影响。
在ATP和Mg²⁺存在下，GCL催化谷*酸和半*氨酸合成γ-谷氨酰半*氨酸；同时ATP去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出GCL活性。


注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、冷冻离心机、水浴锅/恒温培养箱、移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/细胞破碎仪和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件
注意事项：

1. 样本处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，以免影响其活力。如果是匀浆液，避免反复冻

融。

1. 样本测定前先取1-2个样做预实验，如吸光值大于1，应先用试剂一(或者生理盐水)稀释到适当倍数，哺乳动物组织和血液一般稀释3-5倍。

2. 细胞中GCL活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中GCL的提取时可加试剂一（或生理盐水）后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。

3. 测定吸光值时请于水浴后10-40分钟内测完。

实验实例：

1. 取0.1g三叶草加入1mL试剂一进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA测=A测定管-A对照管=0.784-0.415=0.369，ΔA标=A标准管-A空白管=0.371-0.042=0.329，按样本质量计算酶活得：

GCL（U/g 质量）=0.0544×ΔA测÷ΔA标÷W=0.61 U/g 质量。

1. 取0.1g柳树加入1mL试剂一进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA测=A测定管-A对照管=0.530-0.366=0.164，ΔA标=A标准管-A空白管=0.371-0.042=0.329，按样本质量计算酶活得：

GCL（U/g 质量）=0.0544×ΔA测÷ΔA标÷W=0.271 U/g 质量。
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