谷*甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒 微量法

谷*甘肽过氧化物酶（GSH-Px/GPX）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC1195

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前取一瓶加入1.65mL蒸馏水溶解，2-8℃可保存2周；

2、 试剂一工作液：临用前根据样本数量按照试剂一：稀释液=1:1的比例进行配制，现用现配；

3、 试剂二工作液：临用前按2 μL试剂二：10 mL蒸馏水的比例稀释试剂二，现用现配；

4、 试剂三：瓶底若有结晶可50℃水浴溶解，此溶液为饱和溶液，若底部最终还有结晶，吸取上清使用即可；

5、 试剂四：若试剂有析出可40℃加热溶解，也可震荡促进溶解；

6、 标准品：10 mg还原型谷*甘肽。临用前加入0.405 mL蒸馏水溶解为80 μmol/mL的标准溶液备用，2-8℃可保存4周。

产品说明：

谷*甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px或GPX，EC.1.11.1.9）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GPX能够催化还原型谷*甘肽（GSH）生成氧化型谷*甘肽（GSSG），使有毒的过氧化氢还原成无毒的羟基化合物。

GPX催化H₂O₂氧化GSH，产生GSSG，GSH能与DTNB生成在412nm处有特征吸收峰的化合物，412nm下吸光度的下降即可反应GPX的活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、天平、台式离心机、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器/超声破碎仪、EP管。

操作步骤：

一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）  

1、组织：按照组织质量（g）:提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取0.05 g组织，加入1 mL提取液）进行冰浴匀浆。5000 rpm，4℃离心10 min，取上清置冰上待测 (如上清不清澈可以离心更长时间)。

2、细菌、细胞：按照细胞数量10⁴个：提取液体积（mL）500~1000:1的比例（建议500万细胞加入1 mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3 min）然后5000 rpm，4℃，离心10min，取上清置冰上待测 (如上清不清澈可以离心更长时间)。

3、血清（浆）等液体：直接测定。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至412 nm，蒸馏水调零。

2、 将80 μmol/mL标准液用蒸馏水稀释为0.08 μmol/mL的标准溶液，现用现配。（可取10μL 80 μmol/mL标准液和990μL蒸馏水混合配成0.8μmol/mL的标准溶液，再取100μL 0.8μmol/mL的标准溶液和900μL蒸馏水混合配成0.08μmol/mL的标准溶液）

3、 操作表：(在1.5 mL离心管中依次加入下列试剂)

充分混匀，4000 rpm常温离心5 min，取上清于EP管或者96孔板中。

    充分混匀，室温静置15 min，测定412 nm下的吸光度，分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算ΔA测定=A对照管-A测定管，ΔA标准=A标准管-A空白管。空白管和标准管仅需做1-2次。

三、GPX活性计算

1、 抑制百分率的计算

抑制百分率=(A对照管-A测定管) ÷（A对照管-A空白管）× 100%

尽量使样本的抑制百分率在30-70%范围内，越靠近50%越准确。如果计算出来的抑制百分率小于30%或大于70%，则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需适当稀释样本；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样本。

2、 GPX活性计算

（1）按蛋白浓度计算

活力单位定义：每mg蛋白在反应体系中每分钟催化1 nmol GSH氧化定义为一个酶活力单位。

GPX (U/mg prot) =ΔA测定÷（ΔA标准÷C标）×1000×V酶促÷（Cpr×V样）÷T

=200×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

（2）按样本质量计算

活力单位定义：每g样本在反应体系中每分钟催化1 nmol GSH氧化定义为一个酶活力单位。

GPX (U/g 质量)= ΔA测定÷（ΔA标准÷C标）×1000×V酶促÷(V样÷V样总×W)÷T

=200×ΔA测定÷ΔA标准÷W

（3）按细胞数量计算

活力单位定义：每10⁴个细胞在反应体系中每分钟催化1 nmol GSH氧化定义为一个酶活力单位。

GPX (U/10⁴ cell)=ΔA测定÷（ΔA标准÷C标）×1000×V酶促÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T

=200×ΔA测定÷ΔA标准÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活力单位定义：每mL液体在反应体系中每分钟催化1 nmol GSH氧化定义为一个酶活力单位。

GPX (U/mL)= ΔA测定÷（ΔA标准÷C标）×1000×V酶促÷V样÷T=200×ΔA测定÷ΔA标准

C标：标准液混合物的浓度：0.08 μmol/mL；V酶促：酶促反应体系体积，0.25 mL；V样：酶促反应中加入样本体积，0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，5 min；细胞数量：以万计；W：样本质量，g；1000：换算系数，1 μmol=1000 nmol。

注意事项：

1、 吸光度若大于1.5时，建议将样本用提取液稀释后进行测定。

2、 建议一次不要做过多样本以免检测时间过长影响显色，使测定不准确。

实验实例：

1. 取0.1 g小鼠肝脏组织加入1 mL提取液进行匀浆研磨，取上清稀释40倍后再按照测定步骤操作，用96孔板测得A测定管=0.152，A对照管=0.278，A标准管=0.370，A空白管=0.064，计算∆A测定=A对照管-A测定管=0.126，∆A标准=A标准管-A空白管=0.306，按样本质量计算酶活得：

GPX (U/g 质量)=200×ΔA测定÷ΔA标准÷W×40（稀释倍数）=32941 U/g 质量。

2. 取0.1 g杨树叶片加入1 mL提取液进行匀浆研磨，用96孔板测得A测定管=0.199，A对照管=0.259，A标准管=0.370，A空白管=0.064，计算∆A测定=A对照管-A测定管=0.060，∆A标准=A标准管-A空白管=0.306，按样本质量计算酶活得：

GPX (U/g 质量)=200×ΔA测定÷ΔA标准÷W=392 U/g 质量。

相关发表文献：

[1] Yang Yang,Li Jing,Wei Cong,et al. Amelioration of nonalcoholic fatty liver disease by swertiamarin in fructose-fed mice. Phytomedicine. June 2019; 59.(IF4.18)

[2] Xuejuan Xia,Yuxiao,Xing,Guannan Li,et al. Antioxidant activity of whole grain Qingke (Tibetan Hordeum vulgare L) toward oxidative stress in d-galactose induced mouse model. Journal of Functional Foods. June 2018;(IF3.197)

[3] Qilong Wang, Guosheng Xiao, Guoliang Chen,et al. Toxic effect of microcystin-LR on blood vessel development. Toxicological & Environmental Chemistry. Feb 2019;(IF3.547)

[4] Wang H, Li Y Y, Qiu L Y, et al. Involvement of DJ1 in ischemic preconditioninginduced delayed

cardioprotection in vivo[J]. Molecular medicine reports,  2017, 15(2): 995-1001

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