乙醇脱氢酶(ADH)活性检测试剂盒 微量法

乙醇脱氢酶（ADH）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC1085
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 提取液：临用前将粉剂一倒入提取液中，溶液为悬浊液，使用前需摇匀；

2. 试剂二：临用前取1支试剂二加入1mL蒸馏水，可以-20℃分装保存4周，避免反复冻融。1支即可做100T，为延长试剂盒使用时间，遂多给一支。

产品说明：
ADH是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物ADH主要在肝脏生成，肝脏损伤导致ADH释放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否异常。
ADH催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD⁺，NADH在340nm处有吸收峰，而NAD⁺没有；测定340nm 吸光度下降速率，来计算ADH活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可调式移液器、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心20min，取上清置冰上待测。
2、 细菌、细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300W，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；16000g，4℃离心20min，取上清液置冰上待测。

3、血清等液体：直接测定。
二、测定步骤

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340nm，紫外分光光度计用蒸馏水调零。

2. 试剂一在25℃水浴中保温30min以上。

3. 空白管：在微量石英比色皿//96孔板（UV板）中依次加入20μL蒸馏水、8μL试剂二、152μL试剂一和20μL试剂三，迅速混匀后于340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A1和A2。ΔA空白管=A1-A2。（空白管只需做1~2个）

4. 测定管：在微量石英比色皿//96孔板（UV板）中依次加入20μL上清液、8μL试剂二、152μL试剂一和20μL试剂三，迅速混匀后于340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A3和A4。ΔA测定管=A3-A4。

三、ADH活性计算
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。
ADH (U/mg prot) =[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷(Cpr×V样)÷T
              =1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管) ÷Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。
ADH (U/g 质量) =[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶] ÷(W×V样÷V样总)÷T
              =1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管)÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中每10⁴个细胞每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。
ADH (U /10⁴ cell) = [(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
=1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管) ÷细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。
ADH (U/mL) = [(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷V样÷T=1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管)
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10^-4L；10⁶：单位换算系数，1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，1min；细胞数量：以万计。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。
ADH (U/mg prot) =[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷(Cpr×V样)÷T
               =2.68×(ΔA测定管–ΔA空白管) ÷Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。
ADH (U/g 质量) =[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷(W×V样÷V样总)÷T
              =2.68×(ΔA测定管–ΔA空白管)÷W



（3）按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中每10⁴个细胞每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。
ADH (U/10⁴ cell) = [(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
  =2.68×(ΔA测定管–ΔA空白管) ÷细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。
ADH (U/mL) = [(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷V样÷T=2.68×(ΔA测定管–ΔA空白管)
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10^-4L；10⁶：单位换算系数，1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL，需要自行测定；W：样本质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，1min；细胞数量：以万计。
注意事项：

1. 若A3大于1.5或者A3小于A1，则需要将样本用蒸馏水稀释再进行测定，计算公式注意乘以稀释倍数。

实验实例：

1. 取0.1g大鼠肝脏加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007，ΔA测定管=A3-A4=0.8351-0.5341=0.301，按样本质量计算酶活得：

ADH (U/g 质量) =1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管)÷W=1.61×(0.301-0.007)÷0.1=4.7334 U/g 质量。

1. 取马血清直接检测，用微量石英比色皿测得计算ΔA空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007，ΔA测定管=A3-A4=0.6369-0.6036=0.0333，按液体体积计算酶活得：

ADH ((U/mL) =1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管)=1.61×(0.0333-0.007)=0.042343 U/mL。

1. 取小鼠血浆直接检测，用微量石英比色皿测得计算ΔA空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007，ΔA测定管=A3-A4=0.7381-0.7093=0.0288，按液体体积计算酶活得：

ADH (U/mL) =1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管)=1.61×(0.0288-0.007)=0.035098 U/mL。
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