NADP-苹果酸脱氢酶活性检测试剂盒 微量法

NADP-苹
果酸脱氢酶（NADP-MDH）活性检测试剂盒说明书
微量法
货号：BC1055
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前加入500 μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；

2. 试剂三：临用前加入600 μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。

产品说明：
MDH（EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物，连接多条重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD^-依赖的MDH和NADP^-依赖的MDH， NADP-MDH主要存在于真核细胞中。
NADP-MDH催化NADPH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、微量石英比色皿/ 96孔板（UV板）、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件

注意事项：

1. 样本的提取必须在0℃-4℃中操做完成，以防止酶变性失活。

2. 实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一37℃放置。

3. 建议一人加样一人比色。因时间监测范围小，不推荐用96孔UV板同时测多个样本。

4. 用分光光度计时，当初始值小于0.7或者ΔA大于0.5时，建议稀释后测量。

实验实例：

1. 取0.1g心脏组织加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管=A1测定-A2测定=0.7173-0.6399=0.0774，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.6583-0.6562=0.0021，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.0753，按样本质量计算酶活得：

NADP-MDH（U/g 质量）=6430×ΔA÷W=6430×0.0753 ÷0.1=4841.79 U/g 质量。

1. 取5μL血清直接按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管=A1测定-A2测定= 0.6934-0.6854=0.008，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.6583-0.6562=0.0021，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.0059，按血清/血浆体积计算酶活得：

NADP-MDH（U/mL）=6430×ΔA=6430×0.0059=37.937 U/mL。
参考文献：

1. Yao Y X, Li M, Zhai H, et al. Isolation and characterization of an apple cytosolic malate dehydrogenase gene reveal its function in malate synthesis[J]. Journal of plant physiology, 2011, 168(5): 474-480.

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