线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性检测试剂盒

线粒体呼吸链复合体Ⅳ/细*色素C氧化酶活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0945
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：试剂放于试剂瓶内玻璃瓶中。临用前取1支加入13.5mL试剂一溶解，用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融；

2. 试剂三：试剂置于试剂瓶内EP管中；临用前取1支加入2mL试剂一溶解，用不完的试剂-20℃保存2周，避免反复冻融；

3. 工作液的配制：临用前取0.5mL试剂三加入到溶解好的4.5mL试剂二中混合备用（约25T），或者按比例现用现配。

产品说明：
线粒体复合体Ⅳ又称细*色素C氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细*色素C的氧化，并最终把电子传递给氧生成水。还原型细*色素C在550nm有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细*色素C生成氧化型细*色素C，因此550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件
注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA大于0.4，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数），使A1-A2小于0.2，可提高检测灵敏度；若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。

2. 由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量（单独测量）。

3. 本试剂盒试剂足够完成50管反应

4. 附：使用样本重量计算公式：（检测样本数为100T/48S）

A、上清中复合体Ⅳ活力的计算：
单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化降解1nmol还原型细*色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(U/g 质量)=[ΔA上清×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V样)÷T=1099×ΔA上清÷W
ΔA上清：上清测定值；V反总：反应体系总体积，2.1×10^-4L；ε：细*色素C摩尔消光系数，1.91×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V提取：加入提取液体积，1.0mL；W：样本重量，g；T：反应时间，1min；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
B、沉淀中复合体Ⅳ活力的计算：
单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化降解1nmol还原型细*色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(U/g 质量)=[ΔA沉淀×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V样)÷T=440×ΔA沉淀÷W
ΔA沉淀：沉淀测定值；V反总：反应体系总体积，2.1×10^-4L；ε：细*色素C摩尔消光系数，1.91×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V提取：加入提取液体积，0.4mL。W：样本重量，g。T：反应时间，1min；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
C、样本复合体Ⅳ总活力的计算：
样本复合体Ⅳ总活力即为上清中复合体Ⅳ活力与沉淀中复合体Ⅳ活力之和。
按样本质量计算：复合体Ⅳ（U/g 质量）=1099×ΔA上清÷W+440×ΔA沉淀÷W
D、按96孔板计算：
将上述计算公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。
实验实例：

1. 取0.1g兔肝脏进行样本处理，按照测定步骤操作，用微量玻璃比色皿ΔA2=A1空白管-A2空白管=0.7713-0.7669=0.0044，上清液的ΔA1=A1测定管-A2测定管=0.7985-0.7754=0.0231，ΔA上清=ΔA1-ΔA2=0.0231-0.0044=0.0187，沉淀中的ΔA1=A1测定管-A2测定管=0.8843-0.7415=0.1428，ΔA沉淀=ΔA1-ΔA2=0.1428-0..0044=0.1384，按样本质量计算：

上清液中复合体Ⅳ活力(U/g 质量)=1099×ΔA上清÷W=1099×0.0187÷0.1=205.513 U/g 质量
沉淀中复合体Ⅳ活力(U/g 质量)=440×ΔA沉淀÷W=440×0.1384÷0.1 =608.96 U/g 质量
则样本复合体Ⅳ总活力（U/g 质量）=1099×ΔA上清÷W+440×ΔA沉淀÷W
=1099×0.0187÷0.1+440×0.1384÷0.1=814.473 U/g 质量。
相关发表文献：

1. Qiuli OuYang,Nengguo Tao,Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. Frontier in Immunology. February 2018;(IF4.259)

2. Huazhang Zhu,Weizhen Zhang,Yingying Zhao,et al. GSK3β-mediated tau hyperphosphorylation triggers diabetic retinal neurodegeneration by disrupting synaptic and mitochondrial functions. Molecular Neurodegeneration. November 2018;(IF8.274)

3. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2019, 134: 229-238.

1. Bao Z, Xu X, Chao H, et al. ERK/Nrf2/HO-1 pathway-mediated mitophagy alleviates traumatic brain injury-induced intestinal mucosa damage and epithelial barrier dysfunction[J]. 2017.

2. Li N, Qin S, Xie L, et al. Elevated Serum Potassium Concentration Alleviates Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury via Mitochondrial Preservation[J]. Cellular Physiology and Biochemistry, 2018, 48(4): 1664-1674.

参考文献：

1. Willis J H, Capaldi R A, Huigsloot M, et al. Isolated deficiencies of OXPHOS complexes I and IV are identified accurately and quickly by simple enzyme activity immunocapture assays[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2009, 1787(5): 533-538.

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