柠檬酸(CA)含量检测试剂盒 微量法

柠檬酸（CA）含量检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC2155
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂三：为易挥发试剂，用完后尽快密封，-20℃保存；

2. 试剂四：临用前取1支加入1.5 mL试剂一，充分溶解，用不完的试剂2-8℃保存2周。

3. 标准品：2 μmol/mL柠檬酸标准液。

产品说明：
CA是生物体内常见的有机酸，是重要的食品风味物质。此外，CA是三羧酸循环第一步反应的产物。
酸性条件下，柠檬酸还原Cr⁶⁺生成Cr³⁺，在545nm处有特征吸收峰；通过测定545nm吸光值的增加，即可计算出样本中柠檬酸含量。
技术指标：
低检出限：0.04 μmol/mL
线性范围：0.05-5 μmol/mL
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 液体样本中柠檬酸提取：取0.1mL液体加试剂一0.9mL，充分混匀，11000g，4℃离心10min，取上清液置于冰上待测。（若测定值较低，可适当调整液体样本和试剂一的体积比例，如（0.2mL液体样本+0.8mL试剂一）或（0.5mL液体样本+0.5mL试剂一）。）

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。  

2. 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3. 线粒体中柠檬酸提取：称约0.1g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，600g，4℃离心5min；取上清至另一EP管中，11000g，4℃离心10min，弃上清（此上清液可用于细胞质CA含量测定）；向沉淀中加试剂二200μL，以及试剂三2μL，充分悬浮溶解，11000g，4℃离心10min，取上清液置于冰上待测。

二、测定步骤

1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到545nm，分光光度计蒸馏水调零。

2. 试剂一置于30℃水浴中预热30min以上。

3. 操作表（按下表在1.5mLEP管/96孔板管中加入相应试剂）：

三、柠檬酸含量计算

1. 按液体体积计算：

柠檬酸含量（μmol/mL）= C标准液×ΔA测定÷ΔA标准×F= 20×ΔA测定÷ΔA标准

1. 按组织质量计算：

柠檬酸含量（μmol/g 质量）= C标准液×ΔA测定÷ΔA标准×V总÷W = 2×ΔA测定÷ΔA标准 ÷W

1. 按细胞/细菌数量计算：

柠檬酸含量（μmol/10⁴ cell）= C标准液×ΔA测定÷ΔA标准×V总÷N=2×ΔA测定÷ΔA标准÷N

1. 按蛋白浓度计算：

柠檬酸含量（μmol/mg prot）= C标准液×ΔA测定÷ΔA标准 ×V样÷（Cpr×V样）= 2×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr
C标准液：标准品的浓度，2μmol/mL；F：样本稀释倍数，（0.1mL样本+0.9mL试剂一）÷0.1mL样本=10；V总：上清液总体积，1.0mL；W：样本质量，g；N：细胞/细菌数量，以万计；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，需自行测定；V样：加入的样本体积，20μL=0.02 mL。
注意事项：
1、样本处理等过程均需要在冰上进行。
2、试剂五为易致癌物质，实验过程中，需佩戴手套，避免试剂五溅到皮肤上。
3、柠檬酸试剂一不能用于蛋白含量测定，如需测定蛋白含量，需另取组织进行测定。
4、若反应30min后有明显的黑色小颗粒，属于正常现象，需将样本稀释后再测。
5、如果样本吸光值大于0.5（96孔板）或1.0（比色皿），建议将样本用试剂一稀释后进行测定。
实验实例：

1. 取0.1065g竹子叶片加入1mL试剂一，冰上充分研磨，11000g 4℃离心10min，取上清液按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定=A测定管-A空白管=0.185-0.109=0.076，ΔA标准=A标准管-A空白管= 0.292- 0.109=0.183，按样本质量计算得：

柠檬酸含量（μmol/g 质量）=2×ΔA测定÷ΔA标准÷W =7.80 μmol/g 质量。

1. 取0.1094g兔肾脏组织加入1mL试剂一，冰上充分研磨，11000g 4℃离心10min，取上清液按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定=A测定管-A空白管=0.270-0.109=0.161，ΔA标准=A标准管-A空白管= 0.292- 0.109= 0.183，按样本质量计算得：

柠檬酸含量（μmol/g 质量）=2×ΔA测定÷ΔA标准 ÷W= 16.08 μmol/g 质量。

1. 取0.1mL小鼠血清加试剂一0.9mL，充分混匀，11000g 4℃离心10min，取上清液按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定=A测定管-A空白管= 0.174-0.109=0.065，ΔA标准=A标准管-A空白管=0.292-0.109 =0.183，按液体样本的体积计算：

柠檬酸含量（μmol/mL）=20×ΔA测定÷ΔA标准=7.10 μmol /mL。
相关发表文献：

1. Meixi Peng,Dan Yang,Yixuan Hou,et al. Intracellular citrate accumulation by oxidized ATM-mediated metabolism reprogramming via PFKP and CS enhances hypoxic breast cancer cell invasion and metastasis. Cell Death and Disease.March 2019;(IF5.959)

2. Luo M,Luo Y, Mao N,et al. Cancer-Associated Fibroblasts Accelerate Malignant Progression of Non-Small Cell Lung Cancer via Connexin 43-Formed Unidirectional Gap Junctional Intercellular Communication. Cellular Physiology and Biochemistry. November 2018;

3. Zhou Z, Duan Y, Zhou M. Carbendazim‐resistance associated β2‐tubulin substitutions increase deoxynivalenol biosynthesis by reducing the interaction between β2‐tubulin and IDH3 in Fusarium graminearum[J]. Environmental microbiology, 2019.

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