山*醇脱氢酶活性检测试剂盒 微量法

山*醇脱氢酶（SDH）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC2535
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂一：取3.4 mL试剂五加入1瓶试剂一粉剂中溶解，再加入一支试剂四，现用现配，24 h变质；

2. 标准品：临用前加入1.4 mL蒸馏水，即10 μmol/mL NADH标准品。-20℃保存4周，避免反复冻融。

产品说明：
SDH（EC 1.1.1.14）催化山*醇脱氢生成果糖，是调控生物体内山*醇含量的关健酶之一。SDH催化山*醇脱氢生成果糖，同时还原NAD⁺生成NADH，生成的NADH能将电子传递给NBT生成紫色的甲臜，根据这一原理可以计算SDH活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声破碎仪，可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000×g 4℃离心10 min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1 g组织，加入1 mL提取液），进行冰浴匀浆。8000 ×g 4℃离心10 min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1、可见分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长至570 nm，可见分光光度计蒸馏水调零。
2、标准管的测定：将10 μmol/mL NADH标准品用水稀释至1.5、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3 μmol/mL的标准溶液
(1) 标准品稀释表

实验中每个标准管需20µL标准溶液。
（2）标准品测定表

3、样本的测定：

将上述试剂按顺序加微量玻璃比色皿/96孔板中，加试剂一的同时开始计时，记录 10 秒时的初始吸光度A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中准确反应3分钟；迅速取出比色皿并擦干，570 nm下比色，记录3分10秒时的吸光度A2，计算ΔA测定=A2-A1。（整个实验过程要避光）

注意事项：
1.ΔA大于0.7时，建议将样本用提取液稀释后测量，计算公式中乘以稀释倍数。
2.测定过程中样本和工作液在冰上放置，以免变性和失活。
3.比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
参考文献：
Aguayo M F, Ampuero D, Mandujano P, et al. Sorbitol dehydrogenase is a cytosolic protein required for sorbitol metabolism in Arabidopsis thaliana[J]. Plant science, 2013, 205: 63-75.
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