葡萄糖脱氢酶（GCDH)检测试剂盒 微量法

葡萄糖脱氢酶（GCDH）活性检测试剂盒说明书
微量法
货号：BC2695
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前加入7.5 mL试剂一溶解，用不完的试剂2-8℃保存8周；

2. 试剂三：临用前每瓶加入5 mL试剂一溶解，用不完的试剂建议分装后-20℃避光可保存4周；

3. 工作液的配制：按照试剂一：试剂二：试剂三为4：3：2的体积比例充分混匀，现用现配，用前37℃预热10 min。

产品说明：
GCDH（EC 1.1.1.47）催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H，主要存在于多种微生物和高等动物的肝脏中。GCDH是一种制备高含量低聚果糖的理想用酶，同时也是临床血糖测定的诊断用酶，可广泛用于食品工业及医药工业领域中。
GCDH催化D-葡萄糖和NAD生成D-葡萄糖酸和NADH，利用NADH在340nm处吸光值的变化即可反映葡萄糖脱氢酶的活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式低温离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织：按照组织质量（g）︰提取液体积(mL)为1︰5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后，8000g，4℃，离心10 min，取上清置于冰上待测。
细胞或细菌：先收集细胞或细菌到离心管内，离心后弃上清；按照细胞数量（10⁴个）︰提取液体积（mL）为500~1000︰1的比例（建议500万个细胞或细菌加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率200 W，超声3s，间隔7s，总时间5min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
血清（浆）：直接检测。
二、测定步骤

1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2. 操作表：在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂：

• GCDH酶活计算

A、按微量石英比色皿计算：

1. 按样本蛋白浓度计算

酶活定义：每毫克蛋白每分钟产生1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样×Cpr）÷T=1607.7×ΔA÷Cpr

1. 按样本质量计算

酶活定义：每克样本每分钟产生1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCDH酶活（U/g质量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T =1607.7×ΔA÷W

1. 按细胞或细胞数量计算

酶活定义：每10⁴个细胞每分钟产生1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCDH酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样÷V样总×细胞数量（万个））÷T
=1607.7×ΔA÷细胞数量（万个）

1. 按液体体积计算

酶活定义：每mL样本每分钟产生1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCDH酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷V样÷T=1607.7×ΔA
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/ mol /cm；d：比色皿光径，1cm；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol；V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；V样：反应体系中样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1min。
B、按96孔UV板计算：
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔板光径）进行计算即可。
注意事项：

1. 样本提取上清液置于冰上待测，且样本提取完成后建议当天提取当天内测完。

2. 当A1或A2大于1.7时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。

3. 当ΔA大于1.5时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。

实验实例：

1. 取0.1g肝脏加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管=A2测定-A1测定=0.5806-0.5291=0.0515，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.0294-0.0294=0，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.0515-0=0.0515，按样本质量计算酶活得：GCDH酶活（U/g质量）=1607.7×ΔA÷W =1607.7×0.0515÷0.1=827.966U/g 质量。

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