转氢酶-2活性检测试剂盒 微量法

转氢酶-2（TH-2）活性检测试剂盒说明书
微量法
货号：BC3265
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂一：临用前取1瓶加入3mL试剂三。用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融。

2. 试剂二：临用前取1瓶加入10 mL试剂三备用。用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。（1瓶粉剂溶解可做100T，为了延长使用时间，此产品多给1瓶粉剂）

产品说明：
转氢酶位于线粒体的内膜上，又称为线粒体复合体六，催化NADH+NADP⁺和NAD⁺+NADPH相互转化，调节线粒体NAD(H)和NADP(H)平衡。把逆向反应称为TH-2，催化NADPH和NAD⁺生成NADP⁺和NADH。
NADH和NADPH均在340nm有特征吸收，因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD⁺）替代NAD⁺，TH-2催化APAD⁺还原生成APADH，APADH在375nm有特征光吸收，测定375nm光吸收的增加速率，来计算TH-2活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件

注意事项：

1. 如果测定的吸光值过高（高于1.5）或者ΔA大于0.25时，可用提取液或试剂三稀释上清液后再测定。

2. 样本蛋白浓度需自行测定。由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

3. ΔA对照或ΔA测定出现负值为正常现象。

4. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

5. 本试剂盒试剂足够完成100管反应。

6. 附:按样本重量计算公式：（样本检测数为100T/24S）

（1）按微量石英比色皿计算
A、上清中TH-2活力的计算
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。
TH-2（U/g 质量）=[ΔA1×V反总÷（ε×d）]÷(W÷V提取×V样) ÷T=498×ΔA1÷W
ΔA1：上清测定值；V反总：反应体系体积，0.2mL；ε：APADH的消光系数，6.7×10^-3mL/nmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V提取：加入提取液体积，1.0mL；V样：样本体积，0.02mL； T：反应时间，3min。
B、沉淀中TH-2活力的计算
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。
TH-2（U/g 质量）=[ΔA2×V反总÷（ε×d）]÷(W÷V提取×V样) ÷T=398×ΔA1÷W
ΔA2：沉淀测定值；V反总：反应体系体积，0.2mL；ε：APADH的消光系数，6.7×10^-3mL/nmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V提取：复溶沉淀的提取液体积，0.8mL；V样：样本体积，0.02mL；T：反应时间，3min。

C、样本TH-2总活力的计算
样本TH-2总活力即为上清中TH-2活力与沉淀中TH-2活力之和。
按样本质量计算：TH-2（U/g 质量）=498×ΔA1÷W+398×ΔA2÷W
（2）按96孔UV计算
将计算公式中的d-1cm换为d-0.6cm（96孔UV板光径）进行计算即可。
参考文献：

1. Vandock K P, Drummond C A, Smith S L, et al. Midgut and fatbody mitochondrial transhydrogenase activities during larval-pupal development of the tobacco hornworm, Manduca sexta[J]. Journal of insect physiology, 2010, 56(7): 774-779.

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