线粒体异柠檬酸脱氢酶测试盒 三羧酸循环

线粒体异柠檬酸脱氢酶（ICDHm）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
货号：BC2160
规格：50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 提取液二：易挥发试剂，用完后盖紧盖儿后及时放回-20℃保存；

2. 试剂三：临用前加入0.75 mL蒸馏水，充分溶解待用，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

3. 标准品：10 mg α-酮戊二酸。临用前加入684 μL蒸馏水，配成100 μmol/mL标准液，2-8℃保存8周；

4. 工作液的配制：临用前根据用量将试剂一、试剂二按1:1比例混合，现配现用。

产品说明：
线粒体异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，ICDHm），广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，与线粒体基因表达及线粒体其他的功能有关。异柠檬酸脱氢酶在生物体内有两种存在形式，以NAD为辅酶的NAD-依赖型异柠檬酸脱氢酶，和以NADP为辅酶的NADP-依赖型异柠檬酸脱氢酶。
异柠檬酸脱氢酶的主要功能，是在体内三羧酸循环中，催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸，将NAD还原成NADH，通过测定α-酮戊二酸的生成量，可以计算出线粒体异柠檬酸脱氢酶活力高低。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
低温离心机、可见分光光度计、水浴锅/恒温培养箱、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件
注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1），可用提取液三稀释

上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。

1. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

2. 测定蛋白浓度时，由于试剂一本身含有蛋白（约1mg/mL），所以测定时需扣除此部分蛋白。

3. 附：使用样本重量计算公式

A、上清（胞浆）中ICDHm活力计算：
按样本质量计算
酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1 nmol α-酮戊二酸定义为一个酶活性单位。
ICDHm活性（U/g 质量）=x×V样÷(W×V样÷V提取)÷T×10³=25.25×x÷W
V提取：加入提取液体积，1.515mL；V样：加入上清液体积，0.2mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1h=60min；10³：单位换算系数，1μmol =10³nmol。
B、沉淀（线粒体）中ICDHm活力计算：
按样本质量计算
酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1 nmol α-酮戊二酸定义为一个酶活性单位。
ICDHm活性（U/g 质量）=x×V样÷(W×V样÷V提取)÷T×10³=10.1×x÷W
V提取：沉淀重悬时加入提取液体积，0.606mL；V样：加入上清液体积，0.2mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1h=60min；10³：单位换算系数，1μmol =10³nmol。
C、样本ICDHm总活力计算：
样本ICDHm总活力即为上清（胞浆）中ICDHm活力与沉淀（线粒体）中ICDHm活力之和。
按样本质量计算：ICDHm（U/g 质量）=25.25×x÷W+10.1×x÷W
实验实例：

1. 取0.3g小鼠肾脏加入1.5mL提取液一和15μL提取液二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。4℃，1000g离心10min。将上清液移至另一离心管中，4℃，11000g离心15min。上清液即胞浆提取物，在沉淀中加入600μL提取液三和6μL提取液二，超声波破碎，4℃，10000g离心10min，取上清液，分别按操作步骤检测，测得：胞浆ΔA测定=A测定管-A对照管=0，线粒体ΔA测定=A测定管-A对照管=0.767-0.475=0.292，带入标准曲线y=1.0917x+0.0471计算相应的x值，按样本质量计算酶活得：

胞浆中ICDHm活性（U/g质量）=25.25×x÷W=0 U/g质量
线粒体中ICDHm活性（U/g质量）=10.1×x÷W=7.55 U/g质量
样本总ICDHm（U/g 质量）=25.25×x÷W+10.1×x÷W=7.55 U/g质量。
 

1. 取0.3g小化眉加入1.5mL提取液一和15μL提取液二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。4℃，1000g离心10min。将上清液移至另一离心管中，4℃，11000g离心15min。上清液即胞浆提取物，上清液稀释2倍，在沉淀中加入600μL提取液三和6μL提取液二，超声波破碎，4℃，10000g离心10min，取上清液稀释2倍，分别按操作步骤检测，测得：胞浆ΔA测定=A测定管-A对照管=0，线粒体ΔA测定=A测定管-A对照管=0.635-0.487=0.148，带入标准曲线y=1.0917x+0.0471计算相应的x值，按样本质量计算酶活得：

胞浆中ICDHm活性（U/g质量）=25.25×x÷W×2=15.49U/g质量
线粒体中ICDHm活性（U/g质量）=10.1×x÷W×2=2.28 U/g质量
样本总ICDHm（U/g 质量）=25.25×x÷W×2+10.1×x÷W×2=15.49 U/g质量。
相关发表文献：
Xiao Li, Qi Zhao, Jianni Qi, et al. lncRNA Ftx promotes aerobic glycolysis and tumor progression through the PPARγ pathway in hepatocellular carcinoma. International Journal of Oncology. May 2018;(IF3.571)
参考文献：
Igamberdiev A U, Gardeström P. Regulation of NAD-and NADP-dependent isocitrate dehydrogenases by reduction levels of pyridine nucleotides in mitochondria and cytosol of pea leaves[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2003, 1606(1-3): 117-125.
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