磷脂酶C（PLC）检测试剂盒 微量法

磷脂酶C（PLC）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC2425

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液配制：

1．提取液二：试剂易挥发，用完后快速拧盖，封口封缠口。

2．标准品：5μmol/mL对硝基苯*溶液。

3．提取液的配制：临用前根据样本量将提取液一与提取液二1:1混合，切勿一次性全部混合，用多少配多少。

产品说明：

磷脂酶C（EC 3.1.4.3）是一种水解甘油磷酸酯C3位点甘油磷酸酯键的脂类水解酶，广泛存在于微生物及动植物的组织和细胞中，在细胞代谢、细胞传递、生长发育等方面具有重要作用。

磷脂酶C催化水解NPPC产生对硝基苯*，在410nm处有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、超速冷冻离心机、可调式移液枪、天平、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、蒸馏水、冰。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例加入提取液，建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆后于4℃，10 000g离心5min；取全部上清再于4℃、100 000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。

2、 细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃，10 000g离心5min；取全部上清再于4℃、100 000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。

3、 血清（浆）：直接测定。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长到410nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 标准溶液的稀释：将5μmol/mL对硝基苯*溶液用蒸馏水稀释至1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.02、0.01μmol/mL。

3、 标准品稀释表：

备注：实验中每个标准管需20µL标准溶液。

4、 样本测定：（在EP管或者96孔板中加入下列试剂）

三、酶活计算

1、 标准曲线：

以标准品浓度（x，μmol/mL）为横坐标，吸光度ΔA标（y）为纵坐标建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA带入公式中计算浓度x（μmol/mL）。

2、 酶活测定：

（1）按蛋白浓度计算

酶活定义：每毫克蛋白每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯*所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性 (U/mg prot) = x×V样÷(V样×Cpr) ÷T = 0.033× x÷ Cpr

（2）按样本质量计算

酶活定义：每克组织每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯*所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性 (U/g 质量) = x×V样总÷W÷T = 0.033× x÷W

（3）按细菌或细胞数量计算

酶活定义：每10⁴个细胞每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯*所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性(U/10⁴ cell）= x×V样总÷细胞数量÷T= 0.033× x÷细胞数量

（4）按血清（浆）体积计算：

酶活定义：每毫升血清每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯*所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性（U/mL）= x÷T = 0.033× x

V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入的试剂一体积，1mL；W：样本质量，g；细胞数量：以万计；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，30min。

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