羟*氨酸（HYP）含量检测试剂盒 微量法

羟*氨酸（HYP）含量检测试剂盒说明书
微量法
货号：BC0255
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 提取液：自备6 mol/L盐酸溶液，大约需要200mL，常温保存；试剂盒内提供一个30mL棕色空瓶，仅做分装使用，请自行标注试剂名称

2. 6 mol/L盐酸提取液的配制：按浓盐酸（37%）和H₂O的体积比是1：1进行配制。

3. 标准品：0.5 mg/mL羟*氨酸标准品。

产品说明：
HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。
样本经水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲*甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样本水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。

技术指标：
低检出限：0.057 μg/mL
线性范围：0.234-30 μg/mL
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
天平、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、6mol/L盐酸、*溶液和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件
注意事项：

1. 如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者用蒸馏水稀释样本后再进行测定。

2. 试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。

3. 按样本蛋白浓度计算时，需单独提取样本中的蛋白质并测定。

实验实例：

1. 取0.2g小鼠皮肤进行样本处理，取上清后蒸馏水稀释32倍后按测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定=A测定管-A空白管=0.375-0.123=0.252，带入标准曲线y=0.0344x+0.015，R²=0.9975，计算x=6.89，按样本质量计算含量得：

组织羟*氨酸含量（µg/g 质量）=4x÷W×32（稀释倍数）=4×6.89÷0.2×32=4409.6 µg/g 质量。

1. 取8×10⁶个HMC-1细胞进行样本处理，取上清后按测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定=A测定管-A空白管=0.183-0.126=0.057，带入标准曲线y=0.0344x+0.015，R²=0.9975，计算x=1.22，按细胞数量计算含量得：

细胞羟*氨酸含量（µg/10⁶ cell）=2x÷N=2×1.22÷8=0.305 µg/10⁶ cell。

1. 取300μL牛血清进行样本处理，取上清后按测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定=A测定管-A空白管=0.194-0.123=0.071，带入标准曲线y=0.0344x+0.015，R²=0.9975，计算x=1.63，按液体体积计算含量得：

液体羟*氨酸含量（µg/mL）=6.67×x=6.67×1.63=10.87 µg/mL。

参考文献：

1. Naeini A, Miri R, Shafiei N. et al. Effects of topical application of Calendula officinalis gel on collagen and hydroxyproline content of skin in rats[J]. Comparative Clinical Pathology, 2012, 21: 253-257.

2. Ignat’eva N, Danilov N, Averkiev S. et al. Determination of hydroxyproline in tissues and the evaluation of the collagen content of the tissues[J]. Journal of Analytical Chemistry, 2007, 62: 51-57.

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