β-木糖苷酶活性检测试剂盒 微量法

β-木糖苷酶活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC2625
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂一：临用前取1支加入0.555 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂建议-20℃分装保存2周，避免反复冻融（1支粉剂溶解后可做48S，为了延长使用时间，此产品多给1支粉剂）；

2. 标准品：5μmol/mL对硝基 苯*溶液。

产品说明：
β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、细菌和真菌等生物体，是催化木聚糖类半纤维素降解的关键酶，产物木糖可作为碳源应用于微生物发酵。另外，β-木糖苷酶还可以作为生物漂白剂应用于造纸工业，比传统的漂白法环保，具有广泛的应用价值。
β-木糖苷酶催化对硝基 苯*-β-D-木糖苷产生对硝基 苯*，对硝基 苯*在405nm处有特征吸收峰，测定405nm光吸收增加速率，可计算β-木糖苷酶活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、水浴锅、蒸馏水、超声破碎仪。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件

• 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、植物样本：称取约0.1g样本，加1mL提取液充分冰浴匀浆，然后12000rpm，4℃，离心20min，弃沉淀，取20μL上清测定蛋白含量，剩余上清作为待测酶液。

1. 细菌、真菌样本：收集约500万个细胞，加入1mL提取液，超声波破碎（冰浴，功率200w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000rpm，4℃，离心10min，弃沉淀 ，取20μL上清测定蛋白含量，剩余上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1. 可见分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至405nm，分光光度计用蒸馏水调零。

2. 标准液的稀释：用试剂二将标准液稀释至0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μmol/mL，稀释可参考下表。

备注：实验中每个标准管需40µL标准溶液。

1. 样本测定：

三、β-木糖苷酶活性计算
根据标准管的浓度（y，μmol/mL）和吸光度ΔA标准（x，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（x，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（y，μmol/mL）。
1、按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：45℃，pH7.4时，每毫克蛋白质1min内催化产生1μmol对硝基 苯 *的酶量为一个酶活单位。
β-木糖苷酶活性（U/mg prot）=(y×V样)÷(V样×Cpr)÷T=0.05×y÷Cpr
2、按样本质量计算：
酶活定义：45℃，pH7.4时，每克样本1min内催化产生1μmol对硝基 苯 *的酶量为一个酶活单位。
β-木糖苷酶活性（U/g 质量）＝(y×V样)÷(W×V样÷V样总)÷T=0.05×y ÷W
3. 按细胞数量计算：
酶活定义：45℃，pH7.4时，每10⁴个细胞1min内催化产生1μmol对硝基 苯 *的酶量为一个酶活单位。
β-木糖苷酶活性（U/10⁴ cell）= (y×V样)÷(500×V样÷V样总)÷T=0.0001×y
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； V样：加入反应体系中样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万；T：反应时间，20min。

注意事项：

1. 吸光度变化应该控制在0.05~0.6之间。否则加大样本量或稀释样本，注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。

2. 样本蛋白质含量需要另外测定。

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